HPLC的梯度洗脫
發(fā)布日期：2014-07-08
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HPLC的梯度洗脫類似于GC的程序升溫。程序升溫是GC在分析過程中不斷改變溫度，而HPLC的梯度洗脫是在分析過程中不斷改變流動(dòng)相的組成。錄用等度（一種流動(dòng)相）洗脫分離一組組分時(shí)，每一個(gè)峰的值小于最后一個(gè)峰的1/30時(shí)，可考慮用梯度洗脫方法。
一組氯代苯同系物，若用等度洗脫，最后一組分的色譜峰值＞第一個(gè)組分的色譜峰值30倍，選用梯度洗脫，所有組分譜峰的峰寬基本相等，縮小了值的差異，縮短了分析時(shí)間。
梯度洗脫用兩種以上的流動(dòng)相，而且是在儀器運(yùn)轉(zhuǎn)過程中在線混合，必須由特殊的泵件和混合裝置進(jìn)行有效的混合。
1、低壓混合
這種裝置是由幾種不同的流動(dòng)相由控制器按不同的比例打入低壓混合中混合后再由泵打入柱內(nèi)。要求控制器準(zhǔn)確、及時(shí)將不同的流動(dòng)相打入低壓混合器中進(jìn)行有效的混合。
2、高壓混合
高壓混合從兩個(gè)以上的高壓泵中按比例流出的流動(dòng)相的混合器中混合。流動(dòng)相組成比例取決于每個(gè)泵的相對流速。高壓混合裝置可使流動(dòng)相不需脫氣泡的影響小。
3、高低壓混合
這種裝置利用低壓比例閥加高壓混合，僅需一個(gè)泵，流動(dòng)相不需脫氣。流動(dòng)相1由高壓泵打進(jìn)，流動(dòng)相2由壓差重力作用流入混合室中?？刂崎yA、B、C主要是排空、放氣，并能適當(dāng)調(diào)節(jié)兩流動(dòng)的比例。比例閥D、E控制兩流動(dòng)相最后進(jìn)入混合室的比例。
以二元梯度的反相色譜為例，一般先用大比例的弱溶劑（水），而后不斷增大強(qiáng)溶劑（甲醇、乙腈）的比例，減小弱溶劑的比例。弱保留分先離開色譜術(shù)，然后由弱保留組分到強(qiáng)保留組分被逐步洗脫下來。因流動(dòng)相的強(qiáng)度不斷變化，相當(dāng)于無數(shù)個(gè)等度洗脫組成了梯度洗脫。所以梯度洗脫的色譜峰的半寬和相對的值基本相等。
分離檢測人血中16種氨基酸用反相色譜梯度洗脫，C18，氨基酸被衍生化后柴紫外檢測器檢測。流動(dòng)相A為四氫呋喃-甲醇-0.1mol/L乙酸鈉（pH7.2）=5：95：900；流動(dòng)相B 為甲醇。
流速為0.40mL/min,柱溫為40℃。本方法有效地分離了16種氨基酸，最小檢知量為15.0umol/L，線性范圍17.0～1000.0umol/L，各氨基酸的相關(guān)系數(shù)R≈0.998，回收率為89%～95%，RSD＜7.0%。
用反相HPLC等度洗脫方法對喹諾酮抗生素帕珠沙星合成產(chǎn)物做質(zhì)量控制。弱溶劑配制的流動(dòng)相，帕珠沙星為45min色譜峰擠在一起，無法定量。改用數(shù)種HPLC等度洗脫方法，結(jié)果都不理想。用梯度洗脫方很容易解決了問題。
在梯度洗脫時(shí)開始的流動(dòng)相中強(qiáng)溶劑的比例不能太大，否則前面的色譜峰擠在一起。
兩個(gè)梯度之間必須有一個(gè)過渡平衡時(shí)間，如分析氨基酸時(shí)，從31min到32min為平衡時(shí)間。平衡時(shí)間不足，相連的兩個(gè)樣品色譜峰的保留時(shí)間就不一樣，這是因?yàn)榍耙粋€(gè)梯度的流動(dòng)相滯留影響了后一個(gè)流動(dòng)相的組成。
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